Nghiên Cứu Điều Kiện Thích Hợp Lên Men Sinh Tổng Hợp LACTOFERRIN Từ Chủng PICHIA PASTORIS KM71H-3 Tái Tổ Hợp

Tác giả: Trịnh Thị Thu Thủy ^1,2, Nguyễn Thị Thủy ¹ , Trương Quốc Phong^1*

¹ Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội,

²Khoa Công nghệ Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Trích: HỘI NGHỊ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TOÀN QUỐC 2020, CÔNG NGHỆ VI SINH VÀ LÊN MEN

TÓM TẮT

Lactoferrin (LF) là một protein liên kết với sắt không chứa nhân hem, một thành phần trong họ protein trasferrin với chức năng chung là vận chuyển sắt. Là một protein đa chức năng sinh học, LF có khả năng điều hòa hấp thụ sắt trong ruột, đáp ứng miễn dịch, chống oxi hóa, chống phòng ngừa ung thư, và chống viêm… Gen mã hóa LF có nguồn gốc từ bò đã được biểu hiện thành công trong chủng P. pastoris KM71H-3 tái tổ hợp trên môi trường BMMY.

Nghiên cứu này đã khảo sát 3 môi trường khoáng thay thế môi trường BMMY là BMM, 2x-MMP, F22 và đã lựa chọn được môi trường 2x-MMP phù hợp biểu hiện LF ở P. pastoris KM71H-3. Nghiên cứu cũng đã khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ (NH4 + từ 0,5 – 3,0%), nguồn nitơ hữu cơ là pepton (1,0%); cao nấm men (0,5%); cao ngô (0,25%) và nồng độ chất cảm ứng MeOH (0,5 – 2,0%) đến khả năng biểu hiện LF trong môi trường 2x-MMP. Kết quả cho thấy môi trường 2x-MMP với 1,5% NH4 + và 0,25% cao ngô, cảm ứng 0,5% methanol mỗi 24 giờ là môi trường phù hợp để biểu hiện LF. Thành phần môi trường được lựa chọn là phù hợp để có thể lên men sinh tổng hợp lactoferrin ở quy mô lớn.

Từ khóa: Cao ngô, lactoferrin, Pichia pastoris, tái tổ hợp.

MỞ ĐẦU

Lactoferrin (LF) là một protein liên kết với sắt không chứa nhân hem (Embleton et al., 2013), một thành phần trong họ protein trasferrin với chức năng chung là vận chuyển sắt trong máu (Gonzalez-Chavez et al., 2009). LF là một thành phần protein chiếm hàm lượng cao thứ 2 trong sữa sau casein (Nakamura et al., 2001). Hàm lượng LF cũng có sự thay đổi lớn, với nồng độ cao nhất là 7 g/L sữa non của người, 1 g/L đối với sữa người trong giai đoạn tiết sữa và 0,4 mg/L trong huyết thanh của người bình thường và tăng lên 5000 lần khi có sự nhiễm khuẩn. LF có hàm lượng cao trong sữa của động vật có vú như bò, lợn, dê, lạc đà… (Chahardooli et al., 2016; Chen et al., 2004). Nồng độ LF có trong sữa bò thay đổi tùy theo giai đoạn tiết sữa dao động từ 0,02 – 0,2 mg/mL đối với sữa trưởng thành chiếm khoảng 2,4 mg/mL đối với sữa non của bò mới sinh (Sharma et al., 2015).

LF là một protein đa chức năng. Chức năng sinh học đầu tiên của LF thể hiện ở khả năng kết hợp với ái lực cao với sắt và tồn tại bền vững trong một phổ rộng pH, thậm chí cả ở pH rất thấp. LF liên quan đến nhiều chức năng sinh lý khác nhau như điều hòa hấp thụ sắt trong ruột, tăng cường đáp ứng miễn dịch, kháng khuẩn, chống oxi hóa, chống phòng ngừa ung thư, và chống viêm (Adlerova et al., 2008); LF giúp bảo vệ đối với sự nhiễm khuẩn và đặc tính này được nghiên cứu nhiều nhất cho đến nay.

Do có nhiều đặc tính bảo vệ tốt đối với cơ thể nên nhu cầu bổ sung dưới dạng thuốc hoặc thực phẩm chức năng ngày càng tăng (Conesa et al., 2010). Hướng sản xuất LF bằng con đường tái tổ hợp đang được quan tâm do có ưu điểm là chủ động nguồn nguyên liệu so với phương pháp tách chiết LF từ sữa động vật có vú. Trong các hệ biểu hiện, P. pastoris thường được sử dụng hơn do khả năng tổng hợp protein tái tổ hợp cao. Hệ thống biểu hiện P. pastoris đã được sử dụng để biểu hiện LF cho hiệu suất tổng hợp đạt 3,5 g/L (Iglesias-Figueroa et al., 2016). Tuy nhiên, để sản xuất hiệu quả protein LF từ chủng tái tổ hợp cần phải xác định được điều kiện lên men thích hợp để vừa đảm bảo hiệu suất tổng hợp cao nhất vừa có chi phí thấp nhất. Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm (i) Lựa chọn môi trường lên men thích hợp để phù hợp sản xuất LF quy mô lớn thay thế môi trường chuẩn BMMY và (ii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ vô cơ NH4 + và nitơ hữu cơ đến khả năng biểu hiện LF.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chủng P. pastoris KM71H-3 tái tổ hợp mang gen mã hóa lactoferrin bò từ đề tài ĐT.01.18/CNSHCB.

Các môi trường

Môi trường hoạt hóa:

YPD: 1,0% yeast extract, 2,0% peptone, 2,0% glucose.ne (Bio-rad, Mỹ).

Môi trường biểu hiện

BMMY: 1% methanol; 1,34% yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulfate (YNB), 1% yeast extract, 2% peptone, pha trong đệm phosphate 0,1 M, pH 6,0.

BMM: 1% methanol; 1,34% yeast nitrogen base w/o amino acid and ammonium sulfate (YNB), pha trong đệm phosphate 0,1 M, pH 6,0.

2x-MMP: KH2PO4 1,7%; MgSO4.7H20 0,2%; (NH4)2SO4 1,5%; pha trong đệm phosphat 0,1 M, pH 6,0. FM22: KH2PO4 4,29%; (NH4)2SO4 0,5%, CaSO4 1%; K2SO4 1,43%; MgSO4.7H2O 11,7%.

Dung dịch khoáng: PTM4: CuSO4.5H2O 0,2%; NaI 0,008%; MnSO4.H2O 0,3%; (NH4)6Mo7O24.4H2O 0,0148%; H3BO3 0,002%; CoCl2 0,05%; ZnCl2 0,7%; FeSO4.7H2O 2,2%; Biotin 0,02%; H2SO4 0,1%.

Phương pháp lên men sinh tổng hợp lactoferrin trên các môi trường khác nhau

Chủng nấm men P. pastoris KM71H-3 được nuôi cấy biểu hiện trên các môi trường: BMM, 2x-MMP, FM22 và BMMY.

(a) Nuôi khởi động:

Nuôi lắc một khuẩn lạc trong 2 mL YPD ở 28°C trong 24 giờ, tốc độ lắc 150 vòng/phút.

(b) Nuôi biểu hiện:

Pha tăng sinh khối: Sử dụng các môi trường khác nhau: BMM; 2x-MM-P; FM22 bổ sung 0,5 % glycerol; môi trường BMMY được dùng làm đối chứng. Chuyển 1 mL giống khởi động vào các bình 19 mL môi trường sao cho giá trị OD600 ban đầu là 0,5, nuôi lắc ở 28°C trong 24 giờ với tốc độ lắc 150 vòng/phút.

Đối với các thí nghiệm thay đổi nồng độ NH4 + (0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%; 2,5%; 3,0%), bổ sung nguồn nitơ hữu cơ peptone (1,0%), cao nấm men (0,5%) và cao ngô (0,25%). Các thành phần bổ sung được đưa vào môi trường 2X-MMP để chuẩn bị môi trường lên men. Đối với thí nghiệm khảo sát nồng độ chất cảm ứng methanol, thay đổi nồng độ cảm ứng mỗi 24 giờ là 0,5%; 1,0%;1,5%; 2,0%.

Nuôi biểu hiện: Bổ sung môi trường tiếp dưỡng gồm chất cảm ứng methanol và các chất khoáng vi lượng (PTM 4) vào các bình nuôi cấy. Mẫu sinh khối nấm men được thu nhận theo thời gian (mỗi 24 giờ).

Tách chiết protein bằng phương pháp siêu âm

Sinh khối tế bào nấm men được thu nhận bằng ly tâm và bổ sung đệm 50mM Tris-HCl; 2% SDS và đảo trộn đều. Mẫu được tiến hành phá tế bào bằng phương pháp siêu âm trong 2 phút với mức năng lượng 60%, 10 giây hoạt động, 10 giây nghỉ. Sau đó, mẫu được tiến hành ly tâm 9000 vòng/phút ở 4˚C trong 20 phút để loại bỏ cặn tế bào. Phần dịch được giữ lại để tiến hành phân tích SDS-PAGE

Phương pháp điện di SDS – PAGE

Các mẫu protein được tiến hành điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 12% theo phương pháp Laemmli (1970).

Phương pháp lai phân tử Dot Blot

Để đánh giá sự có mặt của LF, mẫu protein được chấm lên màng nitrocellulose. Màng sau đó được khóa bằng sữa gầy 1% trong 1 giờ. Sau 3 lần rửa bằng đệm PBS, mẫu trên màng được ủ với kháng thể bậc 1 là babbit Anti Histag (1:5000) trong đệm PBS 1X, sau đó rửa 3 lần bằng đệm PBS-T và ủ với kháng thể bậc 2 (Anti Rabbit IgG + AP) tỉ lệ 1:30.000 và ủ trong 1,5 giờ. Tín hiệu được phát hiện bằng cách ủ với cơ chất NBT và BCIP trong đệm AP. Cường độ tín hiệu thu được được phân tích bằng phần mềm QuantityOne (Bio-rad, Mỹ).

Tiếp tục xem full “tại đây”

_____________

Tham khảo đơn vị cung cấp Yeast Extract Peptone nhập khẩu:

Sản phẩm giao hàng toàn quốc, xin vui lòng liên hệ với chung tôi:

Công Ty TNHH MTV Eco Bio
Hotline: 0866.818.909
Website: ecobio.vn

Login